小動物活體成像技術(shù)是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中不可或缺的一種工具，它通過非侵入性的方式，對活體狀態(tài)下的生物過程進(jìn)行組織、細(xì)胞和分子水平的定性和定量研究。這項技術(shù)不僅極大地促進(jìn)了我們對生命科學(xué)的理解，還在藥物研發(fā)、疾病模型研究等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。本文將詳細(xì)介紹小動物活體成像技術(shù)的原理，并對一些常見問題進(jìn)行深入分析。

　　二、小動物活體成像技術(shù)原理

　　(一)基本概念

　　小動物活體成像技術(shù)是指應(yīng)用影像學(xué)方法，在不損傷動物的前提下，對活體狀態(tài)下的生物過程進(jìn)行觀測的技術(shù)。通過這項技術(shù)，研究人員可以直觀地觀測到活體動物體內(nèi)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、疾病的發(fā)展過程、基因的表達(dá)變化等生物學(xué)過程。

　　(二)主要技術(shù)類型

　　目前，小動物活體成像技術(shù)主要采用生物發(fā)光(Bioluminescence)與熒光(Fluorescence)兩種技術(shù)。

　　生物發(fā)光技術(shù)

　　原理：利用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA。熒光素酶是一種能夠催化熒光素(luciferin)氧化反應(yīng)產(chǎn)生光的酶。當(dāng)外源性給予熒光素底物時，熒光素酶在活細(xì)胞內(nèi)催化熒光素氧化，從而發(fā)出可見光。

　　特點：生物發(fā)光技術(shù)因其操作簡單、反應(yīng)靈敏，在腫瘤、分子互作及信號傳導(dǎo)等研究中得到了廣泛應(yīng)用。其發(fā)光反應(yīng)不需要外源性激發(fā)光，避免了激發(fā)光對生物體的潛在損傷，且背景噪音低，信噪比高。

　　熒光技術(shù)

　　原理：應(yīng)用熒光蛋白(如GFP，綠色熒光蛋白;RFP，紅色熒光蛋白;Mcherry等)或其他熒光染料標(biāo)記細(xì)胞或蛋白等研究對象。這些熒光標(biāo)記物在特定波長的激發(fā)光照射下，能夠發(fā)出特定波長的發(fā)射光。

　　特點：熒光技術(shù)具有費用低廉、操作簡單等優(yōu)點。然而，由于需要激發(fā)光照射，可能會產(chǎn)生非特異性熒光背景噪音，影響信噪比。此外，熒光信號在體內(nèi)組織中的穿透性相對較弱，限制了其在深層組織成像中的應(yīng)用。

　　(三)系統(tǒng)組成與成像過程

　　生物發(fā)光成像系統(tǒng)組成

　　CCD鏡頭：選擇適當(dāng)?shù)腃CD鏡頭對于體內(nèi)可見光成像至關(guān)重要，它負(fù)責(zé)捕捉動物體內(nèi)發(fā)出的微弱光信號。

　　成像暗箱：成像暗箱屏蔽宇宙射線及一切光源，保持內(nèi)部完全黑暗，防止外界環(huán)境的光污染，確保CCD鏡頭所檢測的光線完全由被檢動物體內(nèi)發(fā)出。

　　軟件系統(tǒng)：負(fù)責(zé)儀器控制和圖像分析，包括圖像采集、處理、分析等功能。

　　成像過程

　　標(biāo)記細(xì)胞：通過分子生物學(xué)克隆技術(shù)，將熒光素酶基因或熒光蛋白基因插入預(yù)期觀察的細(xì)胞的染色體內(nèi)，通過單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶或熒光蛋白的細(xì)胞株。

　　注射底物（生物發(fā)光）：將標(biāo)記好的細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)后，在觀測前需要注射熒光素酶的底物熒光素。熒光素進(jìn)入體內(nèi)后，在熒光素酶的作用下發(fā)出可見光。

　　圖像采集：利用高度靈敏的制冷CCD相機及特別設(shè)計的成像暗箱和成像軟件，采集動物體內(nèi)的發(fā)光圖像。

　　數(shù)據(jù)分析：通過軟件對采集到的圖像進(jìn)行處理和分析，提取出有用的生物學(xué)信息。

　　三、小動物活體成像技術(shù)常見問題分析

　　(一)熒光素酶發(fā)光特性相關(guān)問題

　　熒光素酶的發(fā)光是否需要激發(fā)光？

　　回答：熒光素酶的發(fā)光是生物發(fā)光，不需要激發(fā)光。其發(fā)光反應(yīng)依賴于熒光素酶與熒光素的相互作用，在ATP及氧氣的存在條件下催化熒光素的氧化反應(yīng)產(chǎn)生光。

　　熒光素酶的發(fā)光特性如何？

　　回答：熒光素酶發(fā)光具有特定的動力學(xué)曲線。一般來說，腹腔注射熒光素后約1分鐘左右熒光素酶就開始發(fā)光，10分鐘后強度達(dá)到穩(wěn)定的最高點，在最高點持續(xù)約20-30分鐘后開始衰減，約3小時后發(fā)光全部消失。因此，最佳的檢測時間是在注射后15-35分鐘內(nèi)。

　　如何保證熒光素酶（Luciferase）的穩(wěn)定性？

　　回答：熒光素酶基因是插到細(xì)胞染色體上的，當(dāng)細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時，熒光素酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。此外，在實驗過程中要注意避免對細(xì)胞的過度處理，如長時間培養(yǎng)、多次傳代等，以免影響熒光素酶的表達(dá)穩(wěn)定性。

　　(二)熒光素使用相關(guān)問題

　　熒光素鈉鹽和熒光素鉀鹽有什么區(qū)別？

　　回答：二者在使用效果上無明顯差異，均溶于水。但熒光素鈉鹽的溶解度(100mg/mL)要高于熒光素鉀鹽(60mg/mL)。在體內(nèi)實驗研究中，研究者更傾向于選擇熒光素鉀鹽，這可能與鉀鹽在某些方面的性質(zhì)更適合體內(nèi)實驗有關(guān)。

　　為什么溶解熒光素鈉鹽或者鉀鹽的時候需用不含Ca2?或Mg2?離子的PBS？

　　回答：PBS中的Ca2?、Mg2?離子會抑制某些蛋白酶的活性，同時Mg2?是催化熒光氧化的重要因素，Ca2?是和腔腸素氧化有關(guān)的離子。因此，為了避免這些離子對實驗造成影響，建議使用不含Ca2?或Mg2?離子的PBS來溶解熒光素。

　　熒光素腹腔注射和尾靜脈注射的區(qū)別是什么？

　　回答：熒光素可通過腹腔注射或尾部靜脈注射注入小鼠體內(nèi)。腹腔注射擴(kuò)散較慢，開始發(fā)光較慢，但持續(xù)發(fā)光時間較長;尾部靜脈注射擴(kuò)散快，開始發(fā)光快，但發(fā)光持續(xù)時間較短。因此，在選擇注射方式時需要根據(jù)實驗需求來確定。

　　(三)實驗動物與成像條件相關(guān)問題

　　成像前是否需要對實驗動物進(jìn)行特殊處理？

　　回答：是的，成像前需要對實驗動物進(jìn)行麻醉處理，以確保動物在成像過程中保持靜止?fàn)顟B(tài)。此外，為了減少背景噪音和提高信噪比，還需要對實驗動物進(jìn)行脫毛處理(如果動物毛發(fā)較多的話)，并給動物喂食無自發(fā)熒光的飲食。

　　實驗動物毛發(fā)對成像結(jié)果的影響及解決方法？

　　回答：實驗動物毛發(fā)會對成像結(jié)果產(chǎn)生顯著影響，因為它會吸收和散射光線，導(dǎo)致光信號衰減。解決方法是在成像前通過剃毛或化學(xué)脫毛來去除觀察區(qū)域的毛發(fā)。同時要注意脫毛處理的時間安排(最好在成像前24小時進(jìn)行)，以避免脫毛過程引起的皮膚炎癥對實驗造成影響。

　　如何選擇合適的激發(fā)和發(fā)射濾片進(jìn)行熒光成像？

　　回答：熒光成像時應(yīng)根據(jù)所使用的熒光蛋白或熒光染料的激發(fā)和發(fā)射波長來選擇合適的激發(fā)和發(fā)射濾片。常用的熒光蛋白和熒光染料都有其特定的激發(fā)和發(fā)射波長范圍(如GFP的激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為520nm)，選擇合適的濾片可以確保熒光信號的準(zhǔn)確采集和成像質(zhì)量的提高。

　　四、小動物活體成像技術(shù)的應(yīng)用與展望

　　(一)應(yīng)用領(lǐng)域

　　小動物活體成像技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究的各個領(lǐng)域，包括腫瘤研究、神經(jīng)科學(xué)研究、干細(xì)胞研究、基因表達(dá)調(diào)控研究等。在腫瘤研究中，該技術(shù)可以無創(chuàng)監(jiān)測腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及治療效果;在神經(jīng)科學(xué)研究中，可以用于研究神經(jīng)元的功能和突觸傳遞;在干細(xì)胞研究中，可以觀測干細(xì)胞的移植存活、增殖和在體內(nèi)的分布等。

　　(二)未來展望

　　隨著科技的不斷發(fā)展，小動物活體成像技術(shù)也在不斷進(jìn)步和完善。未來，該技術(shù)有望在更高分辨率、更深組織穿透性、更多成像模式等方面取得突破。同時，與其他新興技術(shù)的結(jié)合(如基因編輯技術(shù)、納米技術(shù)等)也將為小動物活體成像技術(shù)帶來更廣闊的應(yīng)用前景。

　　五、結(jié)語

　　小動物活體成像技術(shù)作為一種強大的非侵入性成像工具，在生物醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。通過深入了解其技術(shù)原理和解決常見問題，我們可以更好地利用這一技術(shù)來探索生命的奧秘和促進(jìn)醫(yī)學(xué)的進(jìn)步。未來，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，小動物活體成像技術(shù)有望在更多領(lǐng)域展現(xiàn)出其獨特的價值和魅力。