小動(dòng)物活體成像技術(shù)作為一種非侵入式的研究手段，在生物醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。它能夠在不傷害動(dòng)物的前提下，對(duì)活體動(dòng)物體內(nèi)的生物過程進(jìn)行定性和定量研究，如腫瘤生長(zhǎng)、疾病發(fā)展、基因表達(dá)變化等。然而，在實(shí)際操作過程中，小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)可能會(huì)遇到各種故障，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本文旨在提供一份常見故障排除指南，幫助研究人員更好地應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)。

一、成像前準(zhǔn)備階段的故障排除

1. 動(dòng)物準(zhǔn)備問題

故障現(xiàn)象：動(dòng)物麻醉效果不佳，影響成像質(zhì)量。

可能原因：

麻醉藥物選擇不當(dāng)或劑量不足。

麻醉設(shè)備故障，如氣體麻醉系統(tǒng)的氣體流量不穩(wěn)定。

排除方法：

根據(jù)動(dòng)物種類和體重選擇合適的麻醉藥物和劑量。對(duì)于小鼠，常用的氣體麻醉藥物是異氟烷，濃度一般為2%與氧氣混合使用。

檢查麻醉設(shè)備，確保氣體流量穩(wěn)定，麻醉面罩密封良好。

在麻醉過程中，應(yīng)持續(xù)監(jiān)測(cè)動(dòng)物的生命體征，如心率和呼吸頻率，確保動(dòng)物處于合適的麻醉深度。

故障現(xiàn)象：動(dòng)物毛發(fā)影響成像效果。

可能原因：

動(dòng)物毛發(fā)未完全去除，導(dǎo)致光信號(hào)衰減。

脫毛方法不當(dāng)，損傷動(dòng)物皮膚。

排除方法：

在成像前一天，使用剃毛或化學(xué)脫毛方法去除觀察區(qū)域的毛發(fā)。對(duì)于黑色毛發(fā)，由于其吸收光線能力強(qiáng)，應(yīng)特別注意完全去除。

脫毛時(shí)應(yīng)小心操作，避免損傷動(dòng)物皮膚。使用理發(fā)推剪去除大部分毛發(fā)后，可用脫毛膏去除殘留的絨毛。

2. 底物給藥問題

故障現(xiàn)象：底物給藥后，動(dòng)物體內(nèi)發(fā)光信號(hào)不明顯或無法檢測(cè)。

可能原因：

底物給藥方式不當(dāng)，如注射部位不準(zhǔn)確或注射速度過快。

底物劑量不足或過量。

底物質(zhì)量問題，如過期或保存不當(dāng)。

排除方法：

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇合適的底物給藥方式，常用的有腹腔注射和尾靜脈注射。腹腔注射時(shí)，應(yīng)確保針頭進(jìn)入腹腔，注射速度適中；尾靜脈注射時(shí)，應(yīng)先將動(dòng)物尾巴置于溫水中擴(kuò)張血管，再緩慢注射。

根據(jù)動(dòng)物體重計(jì)算底物劑量，確保劑量準(zhǔn)確。對(duì)于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)，熒光素的常用劑量為150mg/kg。

檢查底物質(zhì)量，確保在有效期內(nèi)且保存條件符合要求。

二、成像過程中的故障排除

1. 成像設(shè)備問題

故障現(xiàn)象：成像設(shè)備無法正常工作，如CCD鏡頭無法對(duì)焦或成像暗箱漏光。

可能原因：

成像設(shè)備硬件故障，如CCD鏡頭損壞或成像暗箱密封不良。

成像軟件設(shè)置不當(dāng)。

排除方法：

檢查成像設(shè)備硬件，確保CCD鏡頭清潔無損，成像暗箱密封良好。如發(fā)現(xiàn)硬件故障，應(yīng)及時(shí)聯(lián)系設(shè)備供應(yīng)商進(jìn)行維修或更換。

檢查成像軟件設(shè)置，確保曝光時(shí)間、Binning值等參數(shù)設(shè)置合理。對(duì)于生物發(fā)光成像，只需設(shè)置曝光時(shí)間和Binning值；對(duì)于熒光成像，還需根據(jù)熒光物質(zhì)的種類選擇相應(yīng)的激發(fā)光和發(fā)射光濾光片。

2. 成像環(huán)境問題

故障現(xiàn)象：成像過程中出現(xiàn)外界光源干擾，導(dǎo)致成像質(zhì)量下降。

可能原因：

成像暗箱密封不良，外界光線進(jìn)入。

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)其他光源未關(guān)閉或遮擋不當(dāng)。

排除方法：

確保成像暗箱密封良好，關(guān)閉暗箱門后無光線泄露。

在成像過程中，應(yīng)關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室內(nèi)其他光源，或使用遮光布遮擋窗戶等可能漏光的地方。

3. 動(dòng)物體位問題

故障現(xiàn)象：動(dòng)物體位不當(dāng)，導(dǎo)致成像區(qū)域不在視野范圍內(nèi)或成像效果不佳。

可能原因：

動(dòng)物麻醉后體位未固定好，導(dǎo)致在成像過程中移動(dòng)。

成像設(shè)備平臺(tái)調(diào)整不當(dāng)。

排除方法：

在麻醉后，應(yīng)將動(dòng)物固定于成像設(shè)備平臺(tái)上，確保成像區(qū)域朝向上方（即相機(jī)的鏡頭方向），一般采取仰臥位。

調(diào)整成像設(shè)備平臺(tái)的高度和角度，使動(dòng)物成像區(qū)域位于視野中央。

三、成像后數(shù)據(jù)分析階段的故障排除

1. 數(shù)據(jù)質(zhì)量問題

故障現(xiàn)象：成像數(shù)據(jù)質(zhì)量不佳，如信噪比低、背景信號(hào)強(qiáng)等。

可能原因：

成像過程中外界光源干擾或動(dòng)物毛發(fā)未完全去除導(dǎo)致背景信號(hào)強(qiáng)。

成像參數(shù)設(shè)置不當(dāng)，如曝光時(shí)間過長(zhǎng)或過短。

排除方法：

在成像前確保外界光源干擾最小化，動(dòng)物毛發(fā)完全去除。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求合理設(shè)置成像參數(shù)，如曝光時(shí)間和Binning值。對(duì)于信噪比低的問題，可以嘗試增加曝光時(shí)間或提高Binning值；對(duì)于背景信號(hào)強(qiáng)的問題，可以嘗試使用背景熒光低的材料作為動(dòng)物標(biāo)本身下的襯墊，減少金屬載物臺(tái)的反射干擾。

2. 數(shù)據(jù)分析方法問題

故障現(xiàn)象：數(shù)據(jù)分析結(jié)果不準(zhǔn)確或無法得出有效結(jié)論。

可能原因：

數(shù)據(jù)分析方法不當(dāng)或軟件使用不熟練。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不合理或數(shù)據(jù)樣本量不足。

排除方法：

學(xué)習(xí)并掌握合適的數(shù)據(jù)分析方法，如ROI（感興趣區(qū)域）定量分析等。在使用成像軟件時(shí)，應(yīng)仔細(xì)閱讀軟件說明書或參加相關(guān)培訓(xùn)。

在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)階段應(yīng)充分考慮各種因素可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，確保實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理且數(shù)據(jù)樣本量充足。在數(shù)據(jù)分析過程中，應(yīng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮捅尘爸R(shí)對(duì)結(jié)果進(jìn)行合理解釋和推斷。

四、其他常見故障排除

1. 自發(fā)熒光干擾問題

故障現(xiàn)象：成像過程中受到動(dòng)物體內(nèi)自發(fā)熒光的干擾，導(dǎo)致成像效果下降。

可能原因：

動(dòng)物體內(nèi)某些物質(zhì)在受到激發(fā)光照射后產(chǎn)生自發(fā)熒光。

熒光標(biāo)記物波長(zhǎng)與自發(fā)熒光波長(zhǎng)重疊。

排除方法：

在選擇熒光標(biāo)記物時(shí)，應(yīng)盡量避免其波長(zhǎng)與動(dòng)物體內(nèi)自發(fā)熒光波長(zhǎng)重疊。對(duì)于常用的綠色熒光蛋白（GFP），其最大激發(fā)波長(zhǎng)是488nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)是507nm，這與皮膚及毛發(fā)中的膠原蛋白和彈性蛋白等成分的發(fā)射波長(zhǎng)相近，因此在使用GFP時(shí)應(yīng)特別注意自發(fā)熒光的干擾。

可以嘗試使用近紅外波長(zhǎng)的熒光染料作為標(biāo)記物，因?yàn)槠渚哂懈咝旁氡群透畲┩干疃鹊膬?yōu)點(diǎn)。此外，還可以使用iRFP（遠(yuǎn)紅外熒光蛋白）作為報(bào)告基因，該熒光蛋白具有更高的亮度、光穩(wěn)定性和信噪比。

2. 探針濃度問題

故障現(xiàn)象：熒光探針濃度不當(dāng)導(dǎo)致成像信號(hào)弱或無法檢測(cè)。

可能原因：

熒光探針濃度過低導(dǎo)致信號(hào)弱。

熒光探針濃度過高可能導(dǎo)致猝滅現(xiàn)象或動(dòng)物體內(nèi)代謝負(fù)擔(dān)加重。

排除方法：

在實(shí)驗(yàn)初期應(yīng)選擇較高濃度或發(fā)光強(qiáng)度的熒光探針以確保信號(hào)強(qiáng)度足夠。隨著對(duì)探針體內(nèi)靶向及代謝情況的了解逐漸深入后，可以考慮適當(dāng)降低探針濃度以達(dá)到最優(yōu)生物學(xué)效果。

在使用熒光探針前應(yīng)先進(jìn)行成像測(cè)試以確定其發(fā)射波譜和強(qiáng)度，并考察不同批次探針之間是否存在差異以及是否有猝滅現(xiàn)象等。

小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)在使用過程中可能會(huì)遇到各種故障和問題。通過仔細(xì)排查和分析故障現(xiàn)象及其可能原因，并采取相應(yīng)的排除方法，可以有效地解決這些問題并提高成像質(zhì)量和數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作過程中應(yīng)充分考慮各種因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，確保實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理性和數(shù)據(jù)的可靠性。此外，研究人員還應(yīng)不斷學(xué)習(xí)和掌握新的成像技術(shù)和數(shù)據(jù)分析方法以適應(yīng)不斷發(fā)展的生物醫(yī)學(xué)研究需求。