活體成像技術(shù)如何實現(xiàn)細胞追蹤?；铙w成像技術(shù)（in vivo imaging technique）是一種在不損傷實驗動物的前提下，利用影像學方法，對活體狀態(tài)下的生物過程進行細胞和分子水平的定性和定量研究的技術(shù)。這一技術(shù)通過非侵入式、直觀的方式，觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、疾病的發(fā)展過程、基因的表達變化等生物學過程?；铙w成像技術(shù)因其操作簡便、結(jié)果直觀、靈敏度高等特點，在生命科學、醫(yī)學研究及藥物開發(fā)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。本文將詳細介紹活體成像技術(shù)如何實現(xiàn)細胞追蹤。

一、活體成像技術(shù)的原理

活體成像技術(shù)主要包括生物發(fā)光（Bioluminescence）和熒光（Fluorescence）兩種技術(shù)。生物發(fā)光技術(shù)利用熒光素酶（Luciferase）基因標記細胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報告基團（如GFP、RFP、Mcherry等）標記細胞或蛋白等研究對象。

1.1 生物發(fā)光技術(shù)原理

生物發(fā)光技術(shù)通過在哺乳動物體內(nèi)表達熒光素酶基因，使標記的細胞或DNA在給予其底物熒光素（luciferin）后能夠發(fā)光。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)，將部分化學能轉(zhuǎn)化為光能釋放。由于這種發(fā)光現(xiàn)象只存在于活細胞內(nèi)，且光的強度與標記細胞的數(shù)目線性相關(guān)，因此可以實現(xiàn)對活細胞內(nèi)細胞數(shù)量的定量研究。

1.2 熒光技術(shù)原理

熒光技術(shù)則采用熒光報告基團標記細胞或蛋白，利用激發(fā)光激發(fā)熒光基團到達高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光。這種技術(shù)的標記對象較為廣泛，可以是動物、細胞、微生物、基因，也可以是抗體、藥物、納米材料等。常用的熒光報告基團包括綠色熒光蛋白（GFP）、紅色熒光蛋白（DsRed）等。

二、活體成像技術(shù)的實現(xiàn)步驟

活體成像技術(shù)實現(xiàn)細胞追蹤的步驟包括細胞標記、構(gòu)建動物模型、活體成像及圖像分析。

2.1 細胞標記

細胞標記是實現(xiàn)活體成像技術(shù)的基礎(chǔ)。通過分子生物學克隆技術(shù)，將熒光素酶的基因穩(wěn)定整合到預期觀察的細胞的染色體內(nèi)，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶蛋白的細胞株。對于熒光技術(shù)，則采用熒光報告基團直接標記細胞或蛋白。

細胞標記的具體步驟包括質(zhì)粒的擴增和純化、細胞轉(zhuǎn)染、單克隆細胞篩選及熒光素酶活性鑒定。首先，制備帶有熒光素luc轉(zhuǎn)酶報告基因或編碼熒光蛋白基因的真核表達質(zhì)粒并進行擴增純化。然后，取對數(shù)生長期的目標細胞進行轉(zhuǎn)染，將目標細胞、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑及足量的質(zhì)粒載體懸浮液共培養(yǎng)一段時間后，補充新鮮的培養(yǎng)液。接著，通過單克隆細胞篩選技術(shù)，挑選出穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株。最后，利用熒光素酶活性鑒定系統(tǒng)，篩選出高效表達的細胞株。

2.2 構(gòu)建動物模型

構(gòu)建動物模型是實現(xiàn)活體成像技術(shù)的重要環(huán)節(jié)。根據(jù)實驗?zāi)康模梢赃x擇尾靜脈注射、皮下移植、原位移植等方法接種已標記的細胞。例如，在腫瘤模型研究中，將熒光素酶基因標記的腫瘤細胞接種到小鼠體內(nèi)，可以建立各種腫瘤模型，用于實時觀察體內(nèi)腫瘤細胞的增殖、生長、轉(zhuǎn)移情況。

2.3 活體成像

活體成像過程通常包括背景圖拍攝、生物發(fā)光或熒光成像及圖像疊加分析。首先，將實驗動物（如小鼠）經(jīng)過麻醉系統(tǒng)麻醉后放入成像暗箱平臺，利用軟件控制平臺的升降到一個合適的視野，自動開啟照明燈拍攝第一次背景圖。然后，自動關(guān)閉照明燈，在沒有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的光，即為生物發(fā)光或熒光成像。與第一次的背景圖疊加后可以清楚地顯示動物體內(nèi)光源的位置，完成成像操作。

2.4 圖像分析

圖像分析是獲取實驗數(shù)據(jù)的關(guān)鍵步驟。利用成像軟件，使用者可以方便地選取感興趣的區(qū)域進行測量和數(shù)據(jù)處理及保存工作。軟件可以計算出選定區(qū)域發(fā)出的光子數(shù)，從而獲得實驗數(shù)據(jù)。此外，軟件還提供了多種圖像分析功能，如發(fā)光面積、總光子數(shù)、光子強度的相關(guān)參數(shù)，供實驗者參考。

三、活體成像技術(shù)的應(yīng)用

活體成像技術(shù)在細胞追蹤領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，包括腫瘤模型研究、藥物代謝研究、免疫細胞研究、干細胞研究、基因表達與基因功能研究等。

3.1 腫瘤模型研究

活體成像技術(shù)可以實現(xiàn)腫瘤細胞活體成像，通過觀察在細胞內(nèi)用熒光素酶標記的蛋白從而建立細胞模型，適時檢測腫瘤生成和細胞衰老情況。小動物活體成像系統(tǒng)能通過對發(fā)光信號的檢測而追蹤腫瘤的轉(zhuǎn)移過程，包括觀察癌細胞在血管中的停留、外滲和轉(zhuǎn)移灶等一系列過程。此外，還可以利用熒光染料或放射性同位素標記藥物，直接在活體水平觀察到藥物對腫瘤的是否靶向腫瘤、最佳靶向時間及藥物在動物其它器官組織的積累。

3.2 藥物代謝研究

活體成像技術(shù)可以標記與藥物代謝有關(guān)的基因，研究不同藥物對該基因表達的影響，從而間接獲知相關(guān)藥物在體內(nèi)代謝的情況。在藥劑學研究方面，可通過把熒光素酶報告基因質(zhì)粒直接裝在載體中，觀察藥物載體的靶向臟器與體內(nèi)分布規(guī)律。在藥理學方面，可用熒光素酶基因標記目的基因，觀察藥物作用的通路。

3.3 免疫細胞研究

活體成像技術(shù)可以標記免疫細胞，觀察免疫細胞對腫瘤細胞的識別和殺死功能，評價免疫細胞的免疫特異性、增殖、遷移等功能。這對于研究免疫系統(tǒng)的功能和疾病機制具有重要意義。

3.4 干細胞研究

活體成像技術(shù)可以標記干細胞，觀察干細胞在體內(nèi)的增殖、分化及遷移的過程。這對于研究干細胞的生物學特性和臨床應(yīng)用具有重要意義。

3.5 基因表達與基因功能研究

活體成像技術(shù)可以將熒光素酶基因插入到目的基因啟動子的下游，并穩(wěn)定整合于實驗動物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動物模型。通過檢測報告基因的表達情況，可以實現(xiàn)對目的基因的研究。這種技術(shù)可以用于研究動物發(fā)育過程中特定基因的時空表達情況，觀察藥物誘導特定基因表達，以及其它生物學事件引起的相應(yīng)基因表達或關(guān)閉。

四、活體成像技術(shù)的影響因素

活體成像技術(shù)在實際應(yīng)用中受到多種因素的影響，包括CCD的性能、實驗所采用的細胞和基因的表達情況、熒光標記物的選擇、熒光素酶成像時底物濃度和溫度的影響以及自發(fā)熒光的干擾等。因此，在進行活體成像實驗時，需要綜合考慮這些因素，以獲得準確可靠的實驗結(jié)果。

五、結(jié)論

活體成像技術(shù)通過非侵入式、直觀的方式，實現(xiàn)對活體動物體內(nèi)細胞追蹤的研究。這一技術(shù)以其操作簡便、結(jié)果直觀、靈敏度高等特點，在生命科學、醫(yī)學研究及藥物開發(fā)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，活體成像技術(shù)將在未來發(fā)揮更加重要的作用，為疾病的早期診斷和治療提供新的手段和方法。