活體成像技術作為一種革命性的生物醫(yī)學研究工具，允許科學家在不傷害動物的情況下，實時觀察和分析活體動物體內的生物學過程。這項技術在腫瘤學、神經科學、免疫學和藥物開發(fā)等領域具有廣泛的應用。然而，活體成像的深度和穿透力一直是制約其應用效果的關鍵因素。本文將探討如何提高活體成像的深度和穿透力，以期為相關領域的研究提供參考。

　　一、活體成像技術的基本原理與挑戰(zhàn)

　　活體成像技術主要基于生物發(fā)光和熒光成像這兩種方法。生物發(fā)光成像利用熒光素酶基因對細胞或DNA進行標記，當熒光素酶與其底物熒光素相遇時，會發(fā)生化學反應，從而產生明亮的光信號。而熒光成像則采用熒光蛋白或特殊染料作為標記物，這些標記物在外界激發(fā)光源的照射下會發(fā)出熒光。這些穿透組織的光信號隨后被體外高精度的CCD設備捕捉，經過處理，最終轉化為清晰、詳盡的圖像。

　　然而，活體成像技術在實際應用中面臨著諸多挑戰(zhàn)。生物組織中的成分復雜，如蛋白質、脂質和血紅素等物質對光的傳播造成阻礙，導致光信號在穿透組織時發(fā)生散射和吸收，從而降低了成像的深度和穿透力。此外，不同波長的光在組織中的穿透深度也不同，選擇合適的成像波長對于提高成像效果至關重要。

　　二、優(yōu)化成像波長以提高穿透力

　　在NIR-II波段中，水的吸收峰值(接近1450 nm)處，成像可以獲得最高的圖像對比度。研究表明，通過選擇接近1450 nm的成像波長，可以最大程度地減少散射的影響，并提高圖像的對比度。這是因為在這個波長下，水的吸收作用較強，能夠減少散射光對成像質量的干擾。

　　具體來說，在活體成像實驗中，可以使用近紅外波長的熒光染料或熒光蛋白作為標記物。這些標記物在受到激發(fā)光照射時，會發(fā)出接近1450 nm的熒光信號，該信號在組織中的穿透深度較大，且受散射影響較小。例如，使用iRFP(遠紅外熒光蛋白)作為報告基因，其熒光信號在組織中的穿透深度可達數厘米，且具有較高的信噪比。

　　三、減少散射和吸收以提高成像深度

　　除了優(yōu)化成像波長外，還可以通過減少散射和吸收來提高活體成像的深度。以下是一些有效的策略：

　　使用光透明技術

　　光透明技術是一種讓生物組織具有光學透明性的新型技術。通過使用一種或多種試劑組成的混合液通過浸泡、電泳或灌注等處理方式，可以使大塊組織或完整器官達到視覺下透明或光學儀器下可見的效果。這種技術能夠顯著降低組織對光的散射和吸收作用，從而提高成像的深度和穿透力。例如，在活體顱骨光透明實驗中，使用光透明試劑盒可以使小鼠大腦皮層神經網絡、血管網絡及血流流速的觀察與監(jiān)測變得更加清晰和深入。

　　優(yōu)化動物體位和方向

　　實驗動物體內的光學信號會被組織干擾從而發(fā)生衰減。為了達到最大的模型靈敏度，需要確定能夠發(fā)出最高信號強度的動物體位和方向。研究者可以從多個位置拍攝圖像，以確定最佳的動物體位和方向。此外，強烈建議在動物之間使用分隔板，以防止信號的反射和互相干擾。

　　減少動物毛發(fā)和皮膚的干擾

　　深色的動物毛發(fā)和皮膚色素會吸收和散射入射光和發(fā)射光。因此，盡可能使用無毛、白化或Hr突變的動物品系。如果由于動物模型的遺傳背景或免疫能力狀況不允許，可以在成像前做脫毛處理。脫毛處理應在成像前24小時前進行，以避免皮膚炎癥對成像結果的影響。

　　四、提高成像設備的性能

　　除了優(yōu)化成像波長和減少散射和吸收外，還可以通過提高成像設備的性能來提高活體成像的深度和穿透力。以下是一些有效的策略：

　　使用高數值孔徑物鏡

　　高數值孔徑物鏡能夠收集更多的光信號，從而縮短曝光時間并改善成像質量。在活體成像實驗中，使用高數值孔徑物鏡可以提高圖像的清晰度和穿透深度。

　　優(yōu)化熒光濾光片

　　熒光濾光片是活細胞熒光成像實驗最重要的硬件之一。選用具有高透射率的濾光片可以收集盡可能多的熒光信號，從而提高信噪比并改善成像質量。

　　使用鎖焦設備

　　由于活體樣本會四處移動，因此務必確保在延時實驗期間可以正確捕獲焦平面圖像。使用鎖焦設備可以減少達到正確對焦位置所需的Z軸幀數，從而避免在延時實驗中多次暴露樣品于激發(fā)光照明下，提高成像的穩(wěn)定性和深度。

　　五、優(yōu)化成像條件以提高成像效果

　　除了上述策略外，還可以通過優(yōu)化成像條件來提高活體成像的深度和穿透力。以下是一些有效的策略：

　　選擇合適的底物注射方式

　　不同的底物注射方式會對生物發(fā)光造成不同的影響。例如，腹腔注射和尾靜脈注射各有優(yōu)缺點。腹腔注射底物迅速分布全身并能穿過包括大腦在內的血液組織屏障但峰值時間較長;尾靜脈注射則提供更好的再現性和高信號但注射難度較高且代謝較快。因此，在選擇底物注射方式時需要根據實驗需求進行權衡。

　　優(yōu)化曝光時間和像素合并

　　曝光時間和像素合并是影響圖像信噪比的重要因素。在活體成像實驗中，需要根據實驗需求選擇合適的曝光時間和像素合并方式以提高信噪比和穿透深度。例如，在BLI實驗中，可以使用適當的像素合并和短曝光時間拍攝初始圖像;如果沒有檢測到信號，則使用更高的像素合并和更長的曝光時間。

　　給動物喂食無自發(fā)熒光的飲食

　　在熒光成像實驗中，動物的飲食可能會影響成像效果。例如，如果動物飲食中含有富含葉綠素的植物苜蓿，動物腸道就會產生NIR自發(fā)熒光。為了避免基于葉綠素的自發(fā)熒光對成像結果的影響，建議在成像前一周開始給動物喂食不含苜蓿的飲食。

　　六、多模態(tài)成像技術的應用

　　結合多種成像技術可以實現多模態(tài)成像，從而同時獲取不同層面的生物信息并增強研究的深度和廣度。例如，可以結合熒光成像、生物發(fā)光成像和光學成像等技術來實現對活體動物體內生物學過程的全面監(jiān)測和分析。這種多模態(tài)成像技術不僅能夠提高成像的深度和穿透力，還能夠為科學研究提供更加豐富和準確的數據支持。

　　七、總結與展望

　　提高活體成像的深度和穿透力是一個涉及多個方面的復雜問題。通過優(yōu)化成像波長、減少散射和吸收、提高成像設備的性能、優(yōu)化成像條件以及應用多模態(tài)成像技術等方法，可以有效地提高活體成像的深度和穿透力。未來，隨著成像技術的不斷發(fā)展和完善，相信活體成像技術在生物醫(yī)學研究中的應用前景將更加廣闊。

　　總之，提高活體成像的深度和穿透力是一個需要不斷探索和實踐的過程。通過綜合運用多種策略和方法，可以不斷優(yōu)化成像效果并為科學研究提供更加準確和可靠的數據支持。