小動物活體成像系統(tǒng)作為一種先進(jìn)的生命科學(xué)研究工具，在腫瘤治療、感染性疾病治療、免疫學(xué)研究、細(xì)胞追蹤和藥物研發(fā)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。該系統(tǒng)能夠在實時和非侵入性的條件下追蹤小動物體內(nèi)的生物學(xué)過程和疾病發(fā)展的動態(tài)信息，提供高靈敏度和高分辨率成像。然而，成像質(zhì)量受到多種因素的共同影響。本文將對影響小動物活體成像系統(tǒng)成像質(zhì)量的主要因素進(jìn)行詳細(xì)分析。

一、成像系統(tǒng)自身因素

CCD性能

尺寸與像素：電荷耦合器件（CCD）是成像系統(tǒng)的核心部件，其尺寸和像素的大小直接影響成像能力。大像素點能夠增加靈敏度，因為像素點面積更大，能容納更多電子，從而產(chǎn)生更多信號，有助于檢測到微弱的發(fā)光點。但與此同時，像素點的增大也會導(dǎo)致分辨率明顯下降，圖像清晰度變差，甚至出現(xiàn)馬賽克現(xiàn)象。小像素點則能增加分辨率，提高影像質(zhì)量，但在CCD尺寸一定的情況下，增加像素就意味著要縮小像素中的光電二極管，單位像素面積減小會降低感光性能、信噪比和動態(tài)范圍。因此，在追求高分辨率的同時，需要權(quán)衡對圖像質(zhì)量的其他影響。

動態(tài)范圍：動態(tài)范圍的變化以bit值來表現(xiàn)，用于描述生成的圖像所能包含的顏色數(shù)，即灰階。深度是16位的CCD意味著圖像含有2^16種顏色深度的變化，這樣的CCD才能準(zhǔn)確表現(xiàn)所檢測到的熒光信號的微小差異，在圖像上表現(xiàn)出不同的深淺或色彩差異。

信噪比：信噪比是影響成像質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。它不僅與CCD本身有關(guān)，還與系統(tǒng)的整體配置和環(huán)境密切相關(guān)。量子效率（QE值）、讀出噪聲和暗噪聲是影響信噪比的主要因素。高量子效率能夠增加信號強(qiáng)度，提高信噪比；而讀出噪聲和暗噪聲則會降低信噪比，影響圖像質(zhì)量。

溫度：溫度對CCD的性能也有重要影響。一般情況下，溫度越低，因溫度產(chǎn)生的暗噪聲也就越低。但是，當(dāng)溫度降低到一定程度時，亂真電荷就會出現(xiàn)，從而增加了暗電流的值。因此，存在一個最佳溫度值，既能降低溫度帶來的噪聲，又不會引起亂真電荷的增加。

成像系統(tǒng)配置

密閉暗箱：暗箱需要保持良好的恒溫狀態(tài)，以確保動物體溫恒定在適宜范圍（如37℃），從而避免溫度變化對成像質(zhì)量的影響。

麻醉系統(tǒng)：麻醉系統(tǒng)的穩(wěn)定性對成像質(zhì)量也有一定影響。麻醉過深或過淺都可能影響動物的生理狀態(tài)，進(jìn)而影響成像結(jié)果。

軟件分析系統(tǒng)：不同的圖像分析軟件在數(shù)據(jù)處理和分析方面可能存在差異。實驗者需要根據(jù)實際情況選擇合適的軟件，并正確設(shè)置參數(shù)，以獲得準(zhǔn)確的實驗結(jié)果。

二、實驗動物因素

細(xì)胞系與基因表達(dá)

細(xì)胞系：不同的細(xì)胞系表達(dá)蛋白的能力不同，因此實驗采用的細(xì)胞系的好壞在很大程度上影響了熒光成像的結(jié)果。重組基因或融合蛋白的表達(dá)情況也直接影響熒光的強(qiáng)弱，這個過程主要是由啟動子的強(qiáng)弱來控制的。如果實驗中采用了弱啟動子，那么在熒光檢測時，很可能會導(dǎo)致熒光弱很多倍，即使有表達(dá)的部位，也可能因此而無法檢測到。

生物發(fā)光：在生物發(fā)光成像中，熒光素酶基因整合到細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光素酶，當(dāng)外源給予其底物熒光素時，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下催化熒光素的氧化反應(yīng)才能發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。

動物毛發(fā)與皮膚

動物毛發(fā)：動物毛發(fā)對光信號有吸收和散射作用，會顯著降低成像質(zhì)量。因此，在成像前需要對動物進(jìn)行剃毛或化學(xué)脫毛處理，以去除觀察區(qū)域的毛發(fā)，最大限度地收集信號。

皮膚色素沉著：不同生長周期的動物皮膚色素沉著程度不同，特別是在生長期中的皮膚色素沉著是活體成像中的一個重要變量。強(qiáng)烈著色的皮膚可導(dǎo)致大量光信號衰減，導(dǎo)致實驗誤差。

三、實驗條件與操作因素

底物給藥方式

腹腔注射：底物迅速分布全身，并能穿過包括大腦在內(nèi)的血液組織屏障。注射后10～20分鐘發(fā)光信號達(dá)到峰值，60分鐘內(nèi)逐漸減少直至不可檢測。

尾靜脈注射：提供更好的再現(xiàn)性和5～10倍的高信號，但注射難度較高且代謝較快。

預(yù)實驗：第一次使用熒光素酶底物成像或更換新品牌底物時，需要進(jìn)行預(yù)實驗，觀察底物在何時達(dá)到峰值。確定注射熒光素底物和成像之間的最佳延遲時間，并將此時間用于所有實驗以標(biāo)準(zhǔn)化成像數(shù)據(jù)。

熒光標(biāo)記物波長

自發(fā)熒光干擾：大多數(shù)生物體內(nèi)都表現(xiàn)出一種天然的熒光（自發(fā)熒光），這些熒光與標(biāo)記物發(fā)射波長重疊時會導(dǎo)致低信噪比和檢測靈敏度受限甚至無法檢測。例如GFP（綠色熒光蛋白）的最大激發(fā)波長是488nm，最大發(fā)射波長是507nm，這與皮膚及毛發(fā)中的膠原蛋白和彈性蛋白等成分的發(fā)射波長相近，有較高的背景信號。

波長選擇：使用近紅外波長的熒光染料可以提高信噪比和穿透深度；或使用具有更高亮度、光穩(wěn)定性和信噪比的熒光蛋白如iRFP（近紅外熒光蛋白）作為報告基因。

曝光時間與背景熒光

曝光時間：曝光時間的設(shè)置對成像質(zhì)量有重要影響。原則上，如預(yù)實驗時拍攝出圖片非特異性雜點多則需降低曝光時間；反之如信號過弱可適當(dāng)延長曝光時間。但曝光時間的延長不僅增加了目的信號也會放大背景噪音。同一批實驗應(yīng)保持一致的曝光時間以減少實驗誤差。

背景熒光：動物體內(nèi)很多物質(zhì)在受到激發(fā)光激發(fā)后會發(fā)出熒光產(chǎn)生非特異性熒光干擾檢測靈敏度。背景熒光主要來源于皮毛和血液的自發(fā)熒光其中皮毛中的黑色素是主要的自發(fā)熒光源。實驗者可以選擇背景熒光低不容易反光的材料放在動物標(biāo)本身下減少金屬載物臺的反射干擾。

環(huán)境因素

溫度與濕度：室內(nèi)溫度應(yīng)控制在適宜范圍（如≤26℃）以避免成像系統(tǒng)損耗過大；室內(nèi)相對濕度須小于60%且不得有明顯揚塵以保持成像環(huán)境的清潔度。

儀器維護(hù)：儀器使用完畢后如停用時間大于2個小時需將軟件退出關(guān)閉（軟件退出關(guān)閉后成像系統(tǒng)即停止工作處于待機(jī)狀態(tài)有助于減少損耗）；當(dāng)日使用完成后須關(guān)閉電腦但主機(jī)無需斷電以免儀器在特定時間自動啟動軟件拍攝背景文件；同時應(yīng)定期對儀器進(jìn)行清潔和維護(hù)以保證其性能穩(wěn)定。

小動物活體成像系統(tǒng)的成像質(zhì)量受到多種因素的共同影響。為了提高成像質(zhì)量，需要綜合考慮成像系統(tǒng)自身因素、實驗動物因素、實驗條件與操作因素等方面。在成像系統(tǒng)方面，需要選擇合適的CCD尺寸和像素數(shù)量、優(yōu)化動態(tài)范圍和信噪比、控制工作溫度等；在實驗動物方面，需要選擇合適的細(xì)胞系和基因表達(dá)載體、對動物進(jìn)行剃毛或化學(xué)脫毛處理、注意皮膚色素沉著的影響等；在實驗條件與操作方面，需要選擇合適的底物給藥方式和熒光標(biāo)記物波長、合理設(shè)置曝光時間和減少背景熒光干擾、控制環(huán)境溫度和濕度以及定期對儀器進(jìn)行維護(hù)等。通過綜合考慮這些因素并采取相應(yīng)的措施，可以有效提高小動物活體成像系統(tǒng)的成像質(zhì)量從而為生命科學(xué)研究提供更加準(zhǔn)確和可靠的實驗數(shù)據(jù)。